治疗性单克隆抗体属于IgG类，含有N-连接寡糖。典型的IgG类抗体由两条重链和两条轻链组成，它们形成三个不同的结构域，包括两个相同的Fab（抗原结合）结构域和一个Fc结构域。Fc 结构域是重链的同源二聚体，在Asn-297位置带有N-糖基化保守位点。Fc结构域与免疫细胞表面的Fc受体(FcγR)结合来参与免疫细胞的募集，并直接启动免疫反应，包括吞噬作用、免疫细胞激活和细胞因子对抗原展示靶点的刺激。Fc结构域的糖基化介导与FcγR的相互作用并调节抗体依赖性效应器功能，包括抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)，其包含激活自然杀伤细胞以启动癌细胞的裂解，和补体-依赖性细胞毒性（CDC），它涉及靶细胞裂解的启动和补体途径的部署。
研究表明，IgG的Asn297的聚糖含有的核心岩藻糖或末端唾液酸会降低IgG对Fcγ受体的亲和力。无论是敲除编码α1,6-岩藻糖基转移酶 (Fut8) 的基因还是过表达编码GnT-III转移酶 (Mgat3) 的基因都会导致Asn297缺乏核心岩藻糖基化，可以提高把IgG对FcγRIIIa 的亲和力，从而增强ADCC效应。因此单克隆抗体的糖基化修饰分析至关重要。
从广义上讲，治疗性蛋白质的糖基化分析可以在三个水平上进行，即完整蛋白质、糖肽和释放的聚糖。
图片来源Challenges of glycosylation analysis andcontrol: an integrated approach to producing optimal and consistent therapeutic drugs
有多种分析方法可在完整蛋白质水平上进行表征，包括色谱、电泳、MS和其他光谱技术。由于卓越的分辨率，MS已成为在开发过程的许多阶段表征 mAb的关键分析工具，质谱分析常用的离子化技术为MALDI和ESI,二者均为软电离技术，具有很强的互补性，并兼具高通量、高分辨率、高灵敏度等特点，但由于离子化可能引起唾液酸残基等不稳定糖苷键的断裂，分析前需要对糖链进行(全)甲基化衍生或对唾液酸残基进行衍生保护。其中，MALDI是一种快速、简单的糖链离子化方法，对盐等干扰物的耐受力强，因电离产生的离子多为单电荷而便于解析。另外可以通过高分辨率质量分析仪，包括ToF、Orbitrap和傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)仪器来解决小的质量差异。
在质谱分析过程中，糖肽因结构复杂、分子质量大、离子化效率低、残留多肽干扰而较糖链分析更加困难。目前报道的糖肽分析方法主要有一级质谱（MS1）和串联质谱（MS2）。一级质谱水平的糖肽分析：糖肽在MS1水平的直接鉴定依赖于高分辨质谱仪采集糖肽精确分子质量的同位素分布数据。在多肽中，其主要组成元素为C、H、N 等(同位素间均只有1 u差异)。然而，糖肽中含有较多的氧元素，自然界中16O与18O之间存在2 u差异。因此，其特征性的同位素峰型在理论上可以用于糖肽的识别和鉴定，但对质谱仪的性能要求较高。MS2水平的糖肽分析：糖肽的鉴定一般通过串联质谱结合数据库搜索进行确定。常见的串联质谱碎裂方式有碰撞诱导解离（CID）、高能碰撞解离（HCD）、电子转移解离（ETD）。CID碎裂技术能量较高，糖肽裂解作用于肽链上的聚糖，产生一系列与聚糖裂解有关的碎片离子。然而，因糖肽的分子质量较大，CID-MS2图谱无法检测到氧鎓离子信号，不利于糖肽MS2谱图的解析。
聚糖的释放可采用生物酶解和化学水解的方法。N-糖苷酶F(PNGase F)、N-糖苷酶A(PNGase A)、糖苷内切酶H(Endo H)和糖苷内切酶S(Endo S) 是常用的从蛋白质氨基酸链上酶解聚糖的糖苷酶。PNGase F可用于糖肽或完整蛋白上连接的聚糖释放，然后可以利用一系列酶包括：尿素节杆菌唾液酸酶 (ABS)、牛睾丸β-半乳糖苷酶 (BTG)、牛肾 α-岩藻糖苷酶 (BKF)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（GUH）联合作用，根据外切糖苷酶的特异性，可以将共洗脱的聚糖分开。
为提高检测的灵敏度，基于HPLC的聚糖分析工作流程通常包括聚糖的荧光标记。一些荧光标签已连接到N-聚糖上，例如 2-氨基苯甲酰胺 (2-AB) 和 2-氨基苯甲酸 (2-AA)。使用HILIC作为分离模式和使用荧光标记的葡聚糖作为标准物质，不同的操作人员可以在不同的系统上进行快速且高度可重复的完成糖链分析。糖链的分析可从RP-HPLC和CE-LIF平台收集的数据，专用实验数据库（即Glycobase），以及通过HILIC-HPLC/UPLC分析的大量聚糖种类的归一化保留时间值（GU值），再加上外切糖苷酶阵列消化如下图，可以使结构分配相对简单。
使用N-聚糖的外切糖苷酶阵列消化确定单糖组成和连接，本实验中使用的一系列酶包括：尿素节杆菌唾液酸酶 (ABS)、牛睾丸 β-半乳糖苷酶 (BTG)、牛肾 α-岩藻糖苷酶 (BKF)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（GUH）。根据外切糖苷酶的特异性，可以将共洗脱的聚糖分开。
蛋白质的糖基化是一种重要的翻译后修饰，糖基化蛋白中的寡糖为非模板合成，并呈复杂的树枝状结构，据报道仅由6种单糖组成的寡糖链，其理论结构即达到惊人的1012种。宿主细胞、生产工艺等各种影响因素更增加了糖基化修饰结构的复杂性。因此选择合适的方法及工具酶对蛋白质的糖基化修饰进行表征尤为关键。
参考文献
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